Razones para el alto fondo del nuevo reactivo de Trinder TODB

En el uso de el nuevo reactivo de Trinder TODB, el alto fondo es un problema común que afecta los resultados de la detección, mientras que un sellado insuficiente y un lavado incompleto de la placa son factores clave que se pasan por alto fácilmente durante la operación. Estos dos problemas pueden causar un aumento anormal en el fondo de color debido a la unión no específica y la interferencia de sustancias residuales. A continuación se presenta un análisis y solución detallados.

Cierre inadecuado: la fuerza impulsora 'detrás de escena' de las combinaciones no específicas

La función del paso de bloqueo es bloquear los sitios de unión no específicos en la superficie del soporte de reacción (como una placa de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas). Si el sellado no es suficiente, los sustratos, los conjugados enzimáticos y otros componentes del reactivo TODB se adsorberán aleatoriamente en la superficie del soporte, formando una señal de color sin la participación de la sustancia objetivo, aumentando directamente el valor de fondo.

razón específica

1. Tiempo de sellado insuficiente: Generalmente hablando, el sellado requiere colocar a 37 ℃ durante 60 minutos o a temperatura ambiente durante 120 minutos. Si el tiempo se acorta a menos de 30 minutos, los sitios activos en la superficie del soporte no pueden ser cubiertos completamente por la solución de bloqueo (como BSA, leche descremada en polvo), y esas áreas hidrofóbicas que no están bloqueadas adsorberán activamente los componentes proteicos en el sistema de reacción TODB, lo que resulta en la coloración de fondo.

2. Concentración demasiado baja de la solución de bloqueo: Cuando los ingredientes efectivos en la solución de bloqueo son insuficientes, como cuando el BSA original al 5% cae al 1%, no se puede formar una película protectora ajustada entre las moléculas. Componentes como la peroxidasa de rábano picante en el reactivo TODB se adherirán a la pared interna del poro de la placa a través de interacciones hidrofóbicas, y se producirán reacciones no específicas con el sustrato durante la reacción.

3. Fallo de la solución de sellado: Si la solución de sellado se congela y se derrite repetidamente, o se almacena durante más tiempo que su fecha de caducidad, los componentes proteicos internos se deteriorarán y perderán su función de sellado, lo que resultará en muchos sitios "expuestos" en la superficie del soporte, que se convierten en la fuente de las señales de fondo.

Lavado incompleto de la placa: el "efecto de apilamiento" de las sustancias residuales

La función principal del lavado de la placa es eliminar los reactivos libres no unidos (como los anticuerpos no unidos, las sustancias precursoras de TODB). Si el lavado de la placa no es exhaustivo, las sustancias residuales continuarán participando en el desarrollo del color en las reacciones posteriores, permitiendo que la interferencia de fondo se acumule.

Razón específica

1. Demasiados pocos lavados de placa: Las pruebas convencionales requieren lavar la placa de 3 a 5 veces. Si se reduce a menos de 2 veces, los complejos enzimáticos libres residuales en el pocillo no se pueden eliminar por completo, y la reacción reaccionará con el sustrato TODB, lo que resultará en un desarrollo de color adicional.

2. Demasiado residuo de detergente: Después de lavar la placa, si los pocillos no se invierten sobre el papel absorbente y se secan con palmaditas, habrá más residuo de detergente en cada pocillo, y algunos componentes internos interrumpirán el equilibrio del sistema de reacción TODB. Al mismo tiempo, los conjugados enzimáticos residuales se difundirán en los pocillos adyacentes con el líquido, causando contaminación cruzada y elevando el fondo.

3. Hay un problema con la lavadora: Cuando la aguja de la lavadora está bloqueada o la presión es insuficiente, las esquinas de los pocillos de la placa se convertirán en áreas que no se pueden lavar. El reactivo TODB residual se cristalizará después del secado y participará en la reacción cuando se disuelva nuevamente, lo que hará que el color de fondo local se oscurezca.

Resumen: Los detalles operativos determinan la efectividad del control del fondo

Aunque el sellado y el lavado de placas son pasos de rutina, su calidad afecta directamente el nivel de fondo de los reactivos TODB. En el uso práctico, se recomienda adoptar el método de "extender el tiempo de sellado + aumentar el número de lavados de placa", combinado con medidas como verificar la concentración de la solución de sellado y calibrar regularmente la lavadora, lo que puede reducir significativamente el valor de fondo y proporcionar garantía para la precisión de los resultados de la detección.

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