Application of TRIS Buffer in Plasmid Extraction by Agarose Electrophoresis

Tris (Trihidroximetilaminometanos) es una base débil con un pKa de 8,1 a temperatura ambiente de 25°C y un rango de amortiguación eficaz de pH 7,0 ~ 9.2El pH de la solución acuosa de Tris alcalino es de unos 10.5El ácido clorhídrico se añade generalmente para ajustar el valor del pH al valor deseado, de modo que se pueda obtener el amortiguador de este valor de pH.El ADN será desprotonado en tal solución, mejorando así su solubilidad.Si la solución ácida ajustada al pH se sustituye por ácido acético, se obtiene un "tampón TAE" (Tris/Acetato/EDTA),mientras que se obtiene un "tampón TBE" (Tris/borato/EDTA) mediante su sustitución por ácido bóricoEstos dos amortiguadores se utilizan comúnmente en experimentos de electroforesis de ácidos nucleicos. TAE, TBE, etc. preparados por Tris son los reactivos más utilizados para la electroforesis de ADN, y TE (pH 8.0) se utiliza principalmente para disolver el ADN.(TE es una combinación de Tris y EDTA.) 1MTris-HCl6.8 y 1.5MTris-HCl8.8 son los reactivos más utilizados para SDS-PAGE.

Reactivo TRIS

Entre las operaciones convencionales de ingeniería genética, la electroforesis de gel de agarosa es la más utilizada.Identificación y purificación de fragmentos de ADNPor lo general, utiliza un dispositivo de electroforesis horizontal para electroforesis bajo un campo eléctrico con intensidad y dirección constantes.Las moléculas de ADN están cargadas negativamente en tampones de gel (generalmente alcalinos) y migran de electrodos negativos a positivos en un campo eléctrico.La velocidad de migración de las moléculas de ADN depende del tamaño y la conformación de la molécula.La influencia de la intensidad y dirección del campo eléctrico, la composición de las bases, la temperatura y los colorantes incorporados,etc..

OperaciónProceso:

1 tampón TE: (10 mmol/L de Tris-HCl, 1 mmol/L de EDTA)

Puffer de electroforesis (50XTAE)

2 tampón de electroforesis (50XTAE): Tris 242 g, ácido acético glacial 57,1 ml, EDTA (0,5 mol/ L pH 8,0) 100 ml

Diluir 50 veces con agua destilada cuando se utilice.

3 tampón de la muestra (6X): azul bromofenol 0,25%, azul xileno 0,25%, sacarosa 40% (W/V)

4 tampón STET (pH 8,0) (8% de sacarosa, 0,5% de Tritón, 50 mmol/L de EDTA, 10 mmol/L de Tris)

1) Se miden 100 ml de solución de electroforesis TAE, se añade 0,7 g de agarosa, se mezcla bien, se coloca en el horno de microondas, se calienta durante 3 minutos y se disuelve completamente la agarosa.

2) Cierre la placa electroforética limpia y seca con caucho esterilizado y sella el borde con una pequeña cantidad de solución de agarosa.Colocar el peine y ajustar la distancia entre el borde inferior del peine y la placa de electroforesis, generalmente 1-2 mm es apropiado.

3) Cuando la solución de agarosa disuelta se enfríe a unos 50 °C, se añade 5 M L de bromuro de etidio y la concentración final de bromuro de etidio es de 1,0 m g/m L.verter la solución de agarosa en la placa de electroforesis y mantenerla quieta sin moverla.

4) Después de que el gel se haya solidificado por completo (30-45 minutos a temperatura ambiente), retire suavemente el peine, retire la cinta y coloque el gel en la almohadilla de electroforesis.

5) En el proceso de electroforesis, se añadió solución de electroforesis (1'TAE) para cubrir la superficie del gel de agarosa con aproximadamente 1-2 mm de solución de electroforesis.